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 无菌检查阳性结果原因分析方法探讨

药品无菌检查出现阳性结果的原因复杂,主要和实验环境、实验用品、操作人员无菌操作规范程度及供试品真实的无菌水平等有关,本文重点阐述与出现阳性结果有关的诸多实验环境等因素,意在为微生物检验人员作阳性结果原因分析时提供参考。

一.相关因素

1.实验用器皿等相关因素:

实验用器皿、用具等因素可从包括药品外包装上的染菌量、酒精棉球等消毒剂的含菌量(无菌配制,非无菌配制)、培养器的无菌性能、培养基的无菌性等方面考虑。重点介绍药品外包装上的染菌量、酒精棉球等消毒剂的含菌量(无菌配制,非无菌配制)测试

2.实验环境因素:

 无菌检查过程中的空气沉降菌、 工作台面的染菌量、无菌工作服染菌量。

3.实验人员因素:

操作人员双手染菌量、不规范操作。

二.验证方法

1.无菌检查实验用器皿等  

1.1首先应目视检查供试品、无菌培养器包装有否开裂、破损。发现包装破损的不得使用;

1.2培养基包装的塞子是否松动,有松动现象的应不得使用;

1.3药品外包装的消毒有效性

药品外包装上的染菌量不容忽视,必须经充分消毒后转移到无菌操作台面。

药品外包装上的染菌量验证可采用下述方法进行:

(1)取供试品外包装未经消毒直接置紫外灯下30分钟后取样。

(2)取供试品经酒精棉球或消毒液浸泡一定时间,擦干后再暴露在紫外灯下30分钟后取样。

供试液制备:

取供试品3个包装,分别用无菌镊子夹住经无菌氯化钠溶液湿润的无菌棉球,擦拭一周,棉球置100ml无菌氯化钠溶液,另取一块无菌棉球重复擦拭一遍,制成供试液。供试液振摇1分钟经开放式滤膜法过滤、取滤膜培养、计数,得到的数据即可比较药品外包装2种消毒方法的消毒效果。

1.4酒精棉球等消毒剂的含菌量测试

酒精棉球等消毒剂的含菌量测试,可分别测试无菌配制及非无菌配制的消毒剂的含菌量,还需注意新鲜配制的与反复使用的消毒剂含菌量的变化。

测试方法可采用开放式滤膜法过滤、取滤膜培养、计数,得到的数据即可比较不同方法配制及不同时间使用的消毒剂的含菌量。

1.4.1无菌室常用消毒剂的配制:

无菌室使用的消毒剂应在净化台面上配制,需过滤的应准备已灭菌的滤器。配好的消毒剂应在盛放的瓶子上标明名称、配制日期、失效期等。

1.4.1.1 75%酒精棉球:

取95%的酒精,加注射用水制成75%的酒精溶液,取该溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后放入已灭菌的瓶中,备用。取经121℃30分钟灭菌的脱脂棉球,置无菌包装内,倒入75%的酒精溶液,即得。该酒精棉球在48h内使用。如取成品消毒酒精配制的,脱脂棉球需经121℃30分钟灭菌。

1.4.1.2 0.1%新洁尔灭溶液的配制:

取注射用水,加入不同浓度的新洁尔灭溶液,使成0.1%浓度,并搅拌均匀,将配制好的溶液用0.22μm微孔滤膜过滤后放入已灭菌的瓶中,备用。此溶液应在48h内使用。

2实验环境因素 无菌检查过程中的空气沉降菌测试、 工作台面的染菌量测试、无菌工作服染菌量测试

2.1无菌实验应选用10000级环境下置100级净化台或操作台面的无菌室或无菌隔离器中进行。无菌室的洁净度测试可参照洁净室洁净度检查的方法进行并判定。

2.2无菌检查过程中的无菌室环境监测,可采用空气沉降菌测试来完成。

2.3工作台面的染菌量测试

取样时间,按正常的程序消毒,待实验结束后取样。

供试液制备:取5×5cm的灭菌标准规格板,放在净化台操作区表面,用浸有无菌氯化钠溶液的棉拭子在规格板内来回涂抹,棉拭子剪去手握部位后放入100ml无菌氯化钠溶液中制成供试液,以同法操作采样2个表面。振摇供试液,备用。供试液经开放式滤膜法过滤、 取滤膜培养、计数,即可得到工作台面的染菌量。

2.4无菌工作服染菌量测试

取样时间  待操作人员实验结束后用进行。

接触碟制备  取无菌平皿,缓缓浇注事先融化(低于40℃)的营养琼脂培养基至满皿(使成凝固后琼脂表面略高于平皿边缘)凝固后备用。

测试方法:取备妥的平板2块,待操作人员实验结束后,分别在其工作服的双臂靠近手腕处,轻轻印压取样。培养,计数。按企业制定的规定判定结果。

3.实验人员因素 (操作人员双手染菌量测试、不规范操作)。

3.1.1操作人员双手染菌量测试

3.1.2取样时间  实验人员按常规程序洗手、消毒,于无菌检查操作结束后进行。

3.1.3供试液制备  取浸有无菌氯化钠溶液的棉拭子沿着操作人员双手的指跟朝指尖方向拭抹,

3.1.4双手分别拭抹食指到小指各4个指头,棉拭子剪去手握部分,浸入100ml无菌氯化钠溶液,

3.1.5振摇供试液并经开放式滤膜法过滤、 取滤膜培养、计数,即得操作人员双手的染菌量。

3.1.6也可取备妥的营养琼脂平板,待实验结束后,操作人员将双手的五个手指分别在琼脂表面

涂抹。平板置35℃培养,计数,即得。

3.2不规范操作行为

在无菌室的硬件施设符合规定的情况下,要注意无菌操作不规范的行为,主要的有:

3.2.1超大量过滤供试液   有的单位将几批药品用一个滤器过滤(200瓶-400瓶),超大量过滤供试液造成的频繁换瓶,会导致抽入大量空气,引发供试液假阳性结果。就是在正常检查过程中,也要求关机换瓶,以防止抽入大量空气,引发供试液假阳性结果。

3.2.2违反操作规程,在供试品未溶解彻底的情况下过滤,造成堵膜使培养器杯内压力增加,培养器护帽反复弹出,破坏空气滤膜的完整性。

3.2.3抽滤过程中泵速过快  特别在抽滤安瓶装供试液时,集菌仪的泵速不能超过50转,不然过快的泵速也会导致抽入大量空气,导致供试品的假阳性结果。

3.2.4消毒剂的配制与使用管理不规范引起的供试品假阳性的案例并不少见。

3.2.5要重视药品外包装的消毒有效性,因药品外包装上污染的微生物可直接被引入到操作过程。

3.2.6培养基多剂量包装,实验过程中反复抽取很有可能造成污染。

3.2.7要注意无菌衣的洁净度,无菌衣在实施无菌操作前一定要经过灭菌处理。

三.供试品出现阳性结果后的原因追溯方法

样品无菌检查出现阳性结果时,如操作的回顾性追溯及培养器、培养基的阴性对照、实验环境的沉降菌等常规生物监控均无发现原因的,应进行污染菌的溯源调查。过程大致如下:

1.阳性菌种分离、鉴定。

2。相关因素排查

2.1实验操作环境空气污染微生物

方法:浮悬菌采样器采取无菌室空气—空气样本中平板菌落形态与检出阳性菌比较—取形态接近的纯化—镜检—菌体形态与阳性菌比较---一致的继续按阳性菌的鉴别程序鉴定----结果判定。

2.2消毒液微生物污染

消毒液污染的微生物溯源比较复杂,污染微生物的来源有消毒剂本地带入、使用者双手、配制用水、盛放容器等,一一排查的可操作性不强,下面仅介绍与检出阳性菌相关的消毒液排查的方法

方法:

2.2.1菌种分离:阳性检出发现时原消毒液尚保留的,可取消毒液100ml,用开放式过滤器过滤后,生理盐水冲洗300ml,取下滤膜,贴在相应的培养基平板上,(视检出的阳性菌性质选用培养基),厌氧或需氧培养。有菌落生长的,平板菌落形态与捡品阳性菌比较—取形态接近的纯化—镜检—菌体形态与阳性菌比较---一致的继续按阳性菌的鉴别程序鉴定----结果判定。

2.2.2阳性检出发现时原消毒液已废弃,可取一定量的阳性菌接种到无菌方法配制的原消毒液中,放置过夜,取一定量,经开放式过滤器过滤后,用生理盐水冲洗300ml,取下滤膜,贴在相应的培养基平板上,计数回收微生物。如接种的微生物能回收到75%,那么捡品阳性菌的污染源来自消毒液的可能性较大。

2.3生产环境排查

2.3.1到生产现场采集空气微生物,取菌落形态接近的纯化—镜检—菌体形态与阳性菌比较---一致的继续按阳性菌的鉴别程序鉴定----结果判定。

2.3.2阳性检出菌种与以往生产环境中收集的微生物比较,判断。(企业必须自建菌种库)

 

 

 

 

 

实验室供稿

2010.2.9

 微生物限度培养器使用中可能出现的误区分析

1、误区一  微生物限度培养器过滤完成后,在转动取杯器的过程中发生膜破现象。
    1)原因分析:整个微生物限度系统属负压过滤,过滤完成后管路内存在一定的负压,若转动取杯器时速度过快,负压未得到完全释放,就可能发生膜破现象。
    2)操作建议:过滤完成转动取杯器时,会听到卸压声音,将取杯器旋转至培养器下端处即暂停转动取杯器,待卸压完成后(卸压过程约需3~4S),再继续转动取杯器将培养器向上顶起,待取杯器旋转至最上端时即可安全取杯。

2、误区二 使用微生物限度培养器检验纯化水等样品,经培养后滤膜表面无菌落生长即认为是培养器本身灵敏度不够。
    在使用微生物限度培养器检验纯化水、注射用水的过程中,在滤膜表面无菌落生长或生长不明显,原因可能是使用时将1ml纯化水直接加入滤杯中直接过滤,供试液未经过稀释,菌落可能集中在一起;而且由于纯化水,注射用水本身经过净化处理,含菌量很少,检验结果菌落数很少或无菌落生长都是有可能的,同时要注意药典对检验量的要求,如注射用水的检验量应为200ml,可能很容易忽略。
    建议在微生物限度检查中,向培养器中加入供试液的体积较少时,一定要经过适当的稀释,使供试液中含有的微生物能够充分的分散;尤其是在检验纯化水等供试品时,务必达到规定的检验量,在含菌量较少的情况下倘若检验量达不到规定要求的话,就更难得到准确的菌落计数结果。

 集菌仪一般故障检修

1.显示屏无显示:检查电源情况,插座、仪器保险丝等
2.马达运行不平稳: 检查电源电压是否太低(电压低于200V时仪器将出现间歇性运转)
3.泵头转轮不转:先停止转轮, 取下泵盖板,转动转轮,使定紧螺钉外露,拧紧固定螺丝即可。
4.转轮与泵头相擦: 检查转轮上下位置偏向,松开转轮固定螺丝。适当调整转轮位置,然后拧紧固定螺丝
5.仪器空载能运转,负载不能运转时,检查滚轮上的三个滚筒是否卡住,如不能转动,可调换整个滚轮。

如无法解决,请咨询生产厂家或由厂家帮助解决。

 
浙江泰林科技专业研发和生产无菌隔离器、无菌检查隔离系统、VHP、汽化过氧化氢发生器、无菌传递舱、干雾发生器、TOC、总有机碳分析仪、微生物限度检测仪、智能集菌仪、集菌培养器等产品,为生物制药工程和医疗、疾控、科研等行业提供专业验证系统解决方案。